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              蛋白質濃度測定方法大全!

              放大字體  縮小字體 發布日期:2024-04-24
              核心提示:蛋白質的定量分析是生物化學和其它生命學科最常涉及的分析內容,是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標,也是許多生物制品,
              蛋白質的定量分析是生物化學和其它生命學科最常涉及的分析內容,是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標,也是許多生物制品,藥物、食品質量檢測的重要指標。在生化實驗中,對樣品中的蛋白質進行準確可靠的定量分析,則是經常進行的一項非常重要的工作。

              蛋白質是一種十分重要的生物大分子:它的種類很多,結構不均一,分子量又相差很大,功能各異,這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的困難。目前測定蛋白質含量的方法有很多種,下面列出根據蛋白質不同性質建立的一些蛋白質測定方法:
              物理性質:紫外分光光度法。
              化學性質:凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法,BCA法,膠體金法。
              染色性質:考馬氏亮藍染色法、銀染法。
              其他性質:熒光法。
              蛋白質測定的方法很多,但每種方法都有其特點和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎上根據不同情況選用恰當的方法,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結果最精確,但操作復雜,用于大批量樣品的測試則不太合格;雙縮脲法操作簡單,線性關系好,但靈敏度差,樣品需要量大,測量范圍窄,因此在科研上的應用受到限制;而酚試劑法彌補了它的缺點,因而在科研中被廣泛采用,但是它的干擾因素多;考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡便開始重新受到關注;BCA法又以其試劑穩定,抗干擾能力較強,結果穩定,靈敏度高而受到歡迎;膠體金法具有較高的靈敏度,可達到毫微克水平,用于微量蛋白的測定。



              圖片
              常用的測定蛋白質含量方法的比較


              圖片

              下面介紹Folin—酚試劑法,考馬氏亮藍G—250染色法,紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。

              一、 Folin-酚試劑法(又名Lowry)法


              一、實驗原理

              這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學領域得到廣泛的應用。

              此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

              二、優缺點

              優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多;

              缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。

              三、試劑與器材

              1.試劑

              (1)試劑甲:(A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O),溶解于500毫升蒸餾水中。(B)0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(A)與1份(B)混合,即為試劑甲。

              (2)試劑乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克鎢酸鈉,25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水,再加50毫升85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小時,回流結束時,加入150克硫酸鋰,50毫升蒸餾水及數滴液體溴,開口繼續沸騰15分鐘,以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重復滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升,過濾,濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定,酚酞作指示劑,然后適當稀釋,約加水1倍,使最終的酸濃度為1N左右。

              (3)標準蛋白質溶液:精確稱取結晶牛血清清蛋白或球蛋白,溶于蒸餾水,濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9 % NaCl溶液。

              2.器材

              (1)可見光分光光度計;

              (2)旋渦混合器;

              (3)秒表;

              (4)試管16支。

              四、操作方法

              1.標準曲線的測定:取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml)。用水補足到1.0毫升,然后每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于室溫(20~25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑),同樣立即混勻。這一步混合速度要快,否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制出標準曲線。注意:因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深,因此各項操作必須精確控制時間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開始計時,1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類推。待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時,為了防止出錯,必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的順序,逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值。

              2.樣品的測定:取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克),按上述方法進行操作,取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起,同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面,再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。根據所測樣品的吸光度值,在標準曲線上查出相應的蛋白質量,從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。注意,由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度(相對于標準蛋白質)。

              五、注意事項

              (1)對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸鈉(1%),硝酸鈉(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。

              (2含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后會色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。進行測定時,加Folin—酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定,但上述還原反應只在pH=10的情況下發生,故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應即能發生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。


              考馬斯亮藍法

              一、實驗原理

              考馬斯亮藍 (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質濃度,是利用蛋白質―染料結合的原理,定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。目前,這一方法是也靈敏度最高的蛋白質測定法之一。

              考馬斯亮藍 G-250 染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置,由 465 nm 變為 595 nm,溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結合。

              二、優缺點

              優點:(1)靈敏度高,據估計比 Lowry 法約高四倍,其最低蛋白質檢測量可達 1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的消光系數,因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比 Lowry 法要大的多。(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要 2 分鐘即可完成,其顏色可以在 1 小時內保持穩定,且在 5 分鐘至 20 分鐘之間,顏色的穩定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費時和需要嚴格地控制時間。(3)干擾物質少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測定法。

              缺點(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用 g-球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。(2)仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。

              三、試劑與器材

              1、試劑

              考馬斯亮藍試劑:考馬斯亮藍 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中,加入 100 mL 85% 磷酸,用蒸餾水稀釋至 1000 mL。

              2、標準和待測蛋白質溶液

              (1)標準蛋白質溶液結晶牛血清蛋白,預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

              (2)待測蛋白質溶液,人血清,使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。

              3、器材

              試管 1.5×15 cm(×6);

              試管架;

              移液管管 0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);

              恒溫水;

              分光光度計。


              四、操作方法

              1、制作標準曲線

              取 7 支試管,按下表平行操作。

              搖勻,1 h 內以 0 號管為空白對照,在 595 nm 處比色。

              繪制標準曲線:以 A595 nm 為縱坐標,標準蛋白含量為橫坐標,在坐標紙上繪制標準曲線。

              2、未知樣品蛋白質濃度測定

              測定方法同上,取合適的未知樣品體積,使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的 A595 nm 值,在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量,從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。


              五、注意事項

              (1)在試劑加入后的 5-20 min 內測定光吸收,因為在這段時間內顏色是最穩定的。

              (2)測定中,蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上,測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。

              (3)利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用,重復測定吸光度時,比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標準曲線的時候,蛋白標準品最好是從低濃度到高濃度測定,防止誤差。


              一、實驗原理

              BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比,BCA法的操作更簡單,試劑更加穩定,幾乎沒有干擾物質的影響,靈敏度更高(微量檢測可達到0.5μg/ml),應用更加靈活。蛋白質分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物,同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物,在堿性條件下,可以和Cu+結合生成深紫色的化合物,這種穩定的化合物在562nm處具有強吸收值,并且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質的含量。

              二、該方法的優點

              (一) 操作簡單,快速,45分鐘內完成測定,比經典的Lowary法快4倍且更加方便;

              (二) 準確靈敏,試劑穩定性好,BCA試劑的蛋白質測定范圍是20-200μg/ml,微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。

              (三) 經濟實用,除試管外,測定可在微板孔中就進行,大大節約樣品和試劑用量;

              (四) 抗試劑干擾能力比較強,如去垢劑,尿素等均無影響 。

              三、實驗材料

              1.實驗器材

              721分光光度計;

              恒溫水浴槽;

              移液管;

              微量進樣器;

              試管架和試管。

              2.實驗試劑

              (1) BCA試劑的配制 ① 試劑A,1L:分別稱取10g BCA (1%),20g Na2CO3·H2O (2%),1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%),4g NaOH (0.4%) ,9.5g NaHCO3 (0.95) ,加水至1L,用NaOH或固體NaHCO3調節pH值至11.25。② 試劑B,50ml:取2g CuSO4·5H2O (4%),加蒸餾水至50ml。③ BCA試劑:取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩定一周。

              (2)標準蛋白質溶液:稱取40mg牛血清白蛋白,溶于蒸餾水中并定容至100ml,制成400μg/ml的溶液。

              (3)樣品溶液:配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。

              四、實驗方法

              方法一:96 孔板

              1. 配制 BCA 工作液:根據標準品和樣品數量,按 50 體積試劑 A,1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。

              2. 將蛋白標準品按 0 μL,1 μL,2 μL,4 μL,6 μL,8 μL,10 μL 加入 96 孔板的蛋白標準品孔中。加滅菌雙蒸水補足到 10 μL。取 10 μL 待測樣品加入 96 孔板的待測樣品孔中。每個測定要做 2~3 個平行。

              3. 向待測樣品孔和蛋白標準品孔中各加入 200 μL BCA 工作液(即樣品與工作液的體積比為 1:20),混勻。

              4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

              5. 酶標儀 562 nm 波長下測定吸光度。

              6. 制作標準曲線。從標準曲線中求出樣品濃度。

              方法二:試管法

              1. 配制工作液:根據標準品和樣品數量,按 50 體積試劑 A,1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液,充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應。每個測定要做 2~3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規格不同,體系需要放大到實驗將采用的比色杯準確讀數所需要的體積。

              2. BSA 標準品和樣品的準備:樣品用水或其它不干擾顯色反應的緩沖液配制,使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備 3 個平行測定。標準曲線一般 5~6 個點即可。根據樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL,可按下表的次序加入 BSA 標準品、樣品及 BCA 工作液。

              3. 取適量體積的標準蛋白,以蛋白液:工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

              4. 將樣品與標準品在 562 nm 波長下測定吸光度。

              紫外分光光度計法

              一、實驗原理

              這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白 質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受 到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

              二、結果計算

              (1)簡易經驗公式

              蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

              (2)精確計算

              通過計算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通過如下公式計算最終結果:

              蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

              其中d為測定OD值比色杯的厚度

              D為溶液的稀釋倍數

              文章來源:網絡
              編輯:songjiajie2010

               
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